I.
Pendahuluan
Kekuatan pemisahan kromatografi modern yang
dikombinasikan dengan selektifitas dan batas deteksi yang sangat rendah dari
spektrometer
massa modern memungkinkan untuk menganalisis
sampel yang sangat kompleks dengan tingkat kepercayaan yang tinggi
(Linscheid
1994)
Kromatografi
cair adalah teknik pemisahan mendasar di bidang ilmu pengetahuan dan bidang
terkait kimia. Tidak seperti kromatografi gas, yang tidak cocok untuk
nonvolatil dan molekul termal rapuh, kromatografi cair dengan aman dapat
memisahkan rentang yang sangat luas dari senyawa organik juga metabolit obat
molekul kecil untuk peptida dan protein (Agilent 2001).
Detektor tradisional untuk kromatografi cair meliputi indeks bias, elektrokimia, fluoresensi, dan detektor ultraviolet-tampak (UV-Vis). Beberapa diantaranya menghasilkan data dua dimensi, yaitu data yang mewakili kekuatan
sinyal sebagai fungsi waktu.
Lainnya, termasuk fluoresensi dan detektor UV-Vis diodearray,
menghasilkan data tiga-dimensi. Data tiga
dimensi tidak hanya mencakup kekuatan
sinyal namun data spektral
untuk setiap titik waktu
(Agilent 2001).
Spektrometer
massa juga
menghasilkan data tiga dimensi. Selain kekuatan sinyal, juga menghasilkan data spektral massa yang dapat memberikan informasi mengenai berat molekul, struktur, identitas, kuantitas,
dan kemurnian sampel. Data spektral massa
menambahkan kekhususan yang meningkatkan kepercayaan terhadap hasil kedua analisis
kualitatif dan kuantitatif
(Agilent 2001).
Liquid
chromatography mass spectrometry (LC-MS, atau
alternatif HPLC-MS) adalah
teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan
pemisahan fisik dari kromatografi
cair (atau HPLC) dengan kemampuan
analisis massa spektrometer massa. LC-MS adalah teknik yang banyak
digunakan untuk berbagai aplikasi yang memiliki sensitifitas dan spesifisitas
sangat tinggi. Pada umumnya aplikasinya berorientasi pada deteksi dan
identifikasi potensi spesifik bahan kimia terhadap kehadiran bahan kimia
lainnya (dalam campuran yang kompleks) (Sumbono 2010).
Kombinasi kromatografi cair kinerja tinggi dan
spektrometri massa (LC/MS) memiliki dampak yang signifikan terhadap pengembangan
obat selama dekade terakhir. Perbaikan secara terus menerus dalam teknologi
antarmuka LC/MS dikombinasikan dengan fitur canggih untuk analisis struktur,
kualitatif dan kuantitatif, telah menghasilkan lingkup aplikasi
yang lebih luas (Lee 1999).
II.
Pembahasan
Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS) adalah
teknik analisis yang menggabungkan kemampuan
pemisahan fisik dari kromatografi cair dengan spesifisitas deteksi spektrometri massa. Kromatografi cair memisahkan komponen-komponen sampel dan kemudian ion
bermuatan dideteksi oleh spektrometer massa. Data LC-MS dapat digunakan untuk memberikan informasi tentang berat molekul, struktur, identitas dan kuantitas komponen sampel tertentu
(Agilent 1998).
Keuntungan
dari LC-MS yaitu dapat menganalisis lebih luas berbagai komponen,
seperti senyawa termal labil, polaritas tinggi atau bermassa molekul tinggi, bahkan juga protein. Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi relatif
dengan lapisan kimia partikel-partikel (fase diam) dan elusi pelarut melalui kolom (fase gerak).
Komponen elusi
dari kolom kromatografi kemudian diteruskan ke spektrometer massa melalui antarmuka khusus
(Gates 2005).
Gambar 1 Antarmuka
LC-MS dengan ionisasi elektrospray
spektrometer massa (Scripp 2014)
A.
Instrumen
LC-MS
1.
HPLC
Kerja HPLC pada
prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya
terdiri atas kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada
HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai ke detektor
(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah (Himawan 2010).
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom
ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran, karena
perbedaan kekuatan interaksi antara larutan terhadap fasa diam. Larutan yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, larutan yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka larutan
tersebut akan keluar kolom, kemudian dideteksi oleh detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram (Isnawati 2013).
2.
Sumber
ion
Beberapa
sumber ion yang digunakan dalam LC-MS dalam Scripp 2014 yaitu :
·
Ionisasi
elektrospray (ESI)
Ionisasi elektrospray (ESI) adalah metode yang digunakan untuk analisis peptida, protein, karbohidrat, oligonukleotida kecil,
polimer sintetis, dan lipid. ESI menghasilkan molekul gas
terionisasi langsung dari larutan cair
yang
menghasilkan semprotan tetesan
(droplet) dalam medan listrik. Sampel larutan disemprotkan dari daerah
medan listrik yang kuat di ujung jarum logam yang dipertahankan pada potensial 700 V sampai 5000 V. Jarum berfungsi untuk membuat
larutan menjadi droplet saat disemprotkan. Gas kering dan
panas, atau keduanya diterapkan pada droplet pada tekanan atmosfer sehingga menyebabkan pelarut
menguap dari setiap droplet. Sebagai ukuran menurunnya tetesan droplet
dilihat dari densitas muatan pada
permukaannya yang meningkat. Tolakan kolom
timbal balik antara muatan dipermukaan menjadi lebih besar sehingga melebihi kekuatan tegangan permukaan, dan
ion dikeluarkan dari droplet melalui Taylor cone
(Gambar 2). Kemungkinan lain yaitu droplet meledak dan
kemudian melepaskan ion. Dalam
kedua kasus tersebut,
ion-ion yang muncul diarahkan ke dalam lubang melalui lensa elektrostatik yang
mengarah ke vakum dari analisis massa. Karena ESI melibatkan pergerakan terus menerus dari larutan, sehingga cocok untuk menggunakan ESI sebagai antarmuka dengan HPLC atau elektroforesis
kapiler .
Ionisasi
elektrospray kondusif untuk pembentukan molekul kecil bermuatan tunggal, tetapi
dapat
juga untuk molekul bermuatan banyak dari molekul yang lebih besar,
hal ini karena spektrometer
massa
mengukur rasio massa terhadap
muatan (m/z) sehingga
memungkinkan untuk mengamati molekul yang sangat besar dengan rentang massa
yang relatif kecil.
Pelarut yang digunakan dalam ESI dipilih
berdasarkan kelarutan senyawa,
volatilitas pelarut dan kemampuan pelarut untuk
menyumbangkan proton. Pelarut utama protik
yang biasa digunakan yaitu metanol (50/50, metanol/air) atau asetonitril (50/50, acetonitrile/H2O), sedangkan untuk pelarut pendukung aprotik digunakan 10% DMSO dalam air, serta isopropil alkohol
untuk meningkatkan kelarutan beberapa senyawa. Bila 100% air digunakan di ESI, tekanan uap air
yang relatif rendah memiliki efek yang merugikan pada sensitifitas, sensitifitas yang baik diperoleh ketika
menggunakan pelarut organik yang mudah
menguap. Beberapa senyawa memerlukan
penggunaan kloroform dengan
0,1% asam format untuk
memudahkan ionisasi.
Buffer seperti Na+, K+, fosfat, dan
garam dapat menurunkan tekanan uap droplet sehingga mengurangi sinyal melalui peningkatan
tetesan tegangan permukaan yang
mengakibatkan
penurunan volatilitas.
Buffer yang mudah menguap seperti amonium asetat
dapat digunakan secara lebih efektif.
Tabel
1 Keuntungan dan Kerugian dari ESI
Keuntungan
|
Kekurangan
|
·
Rentang massa praktis hingga
70.000 Da
|
·
Adanya garam-garam dan agen pasangan ion seperti TFA
dapat mengurangi snsitifitas
|
·
Sensifitas yang baik dengan
femtomol untuk sensitifitas pikomol tipikal rendah
|
·
Campuran kompleks dapat mengurangi sensitifitas
|
·
Metode ionisasi paling lembut,
mampu menghasilkan kompleks nonkovalen dalam fase gas
|
·
Analisis campuran simultan bisa menjadi rendah
|
·
Mudah beradaptasi dengan
kromatografi cair
|
·
Beberapa pengisian dapat membingungkan terutama dalam
analisis campuran
|
·
Mudah beradaptasi dengan tandem
analisis massa seperti perangkap ion dan instrument quadrupole tiga
|
·
Kemurnian sampel sangat penting
|
·
Beberapa pengisian memungkinkan
untuk analisis ion massa yang tinggi dengan kisaran instrument m/z relatif
rendah
|
·
Carryover dari sampel ke sampel
|
·
Tidak ada gangguan matrik
|
Gambar 2 Ionisasi elektrospray
spektrometer massa
·
Ionisasi
nanoelektrospray (nanoESI)
Elektrospray aliran rendah disebut
juga nanoelektrospray
(nanoESI) adalah
variasi pada ESI, dimana jarum semprot dibuat sangat kecil dan diposisikan dekat dengan pintu masuk ke analisis massa sehingga
jumlah sampel yang dibutuhkan
menjadi sedikit.
Laju alir untuk
sumber nanoESI berkisar puluhan hingga
ratusan nanoliter per menit. Untuk mendapatkan aliran rendah, nanoESI
menggunakan penghasil emisi dan dalam beberapa kasus menggunakan
metalisasi
kaca atau leburan silika yang memiliki lubang kecil (~5μ). Sampel terlarut ditambahkan
ke emitor dan tekanan ~30 PSI diterapkan ke belakang emitor. Curahan sampel
pada laju aliran yang sangat rendah memungkinkan untuk sensitifitas tinggi. Emiter diposisikan
sangat dekat dengan pintu masuk analisis massa, karena itu
transmisi ion ke analisis massa jauh lebih
efisien. Selain itu, karena droplet biasanya lebih kecil
dengan nanoESI daripada ESI normal, jumlah penguapan yang diperlukan untuk
memperoleh pembentukan ion jauh lebih sedikit,
sehingga
nanoESI lebih toleran terhadap garam dan kotoran lainnya. Kurangnya penguapan
pada nanoESI menyebabkan kotoran tidak
terkonsentrasi turun sebanyak pada ESI .
Gambar 3 Pembentukan ion dari sumber ionisasi elektrospray
·
Ionisasi
kimia tekanan atmosfer (APCI)
APCI menjadi sumber ionisasi penting karena menghasilkan ion langsung dari larutan dan mampu menganalisis senyawa yang relatif nonpolar. Sama seperti elektrospray, efluen cair dari APCI dimasukkan langsung ke sumber ionisasi,
tetapi droplet tidak bermuatan dan sumber APCI berisi pemanas uap dapat mempercepat desolvasi/penguapan dari tetesan. Molekul sampel menguap dalam wilayah reaksi molekul
ion pada tekanan atmosfer.
Gambar 4 Ionisasi kimia tekanan
atmosfer (APCI) spektrometer massa
Ionisasi
APCI berasal dari pelarut yang terionisasi dari korona
tidak bermuatan. Ion pelarut berada pada kondisi tekanan atmosfer,
maka ionisasi kimia molekul analit sangat efisien. Pada molekul analit tekanan atmosfer sering
bertabrakan dengan ion pereaksi, sehingga transfer proton (untuk protonasi
reaksi MH+) terjadi dalam muatan positif, dan transfer elektron atau kehilangan proton ([M-H]-) terjadi
dalam muatan negatif. Pengaruh kelompok pelarut pada ion pereaksi dan tekanan gas yang tinggi,
dapat mengurangi fragmentasi selama ionisasi dan menghasilkan ion molekul yang utuh.
·
Fotoionisasi
tekanan atmosfer (APPI)
Fotoionisasi
tekanan atmosfer (APPI) menjadi sumber ionisasi penting karena menghasilkan ion langsung dari larutan dengan latar belakang relatif rendah dan mampu menganalisis senyawa yang relatif nonpolar. Sama
dengan APCI, efluen cair dari APPI dimasukkan langsung ke sumber ionisasi. Perbedaan utama antara APCI dan APPI yaitu pada APPI sampel
menguap melewati sinar ultra-violet (sumber cahaya kripton dipancarkan pada 10,0 eV dan 10,6 eV). APPI lebih sensitif dibandingkan
dengan ESI atau APCI, sebab memiliki rasio sinyal
kebisingan yang lebih rendah karena ionisasi latar belakang. Sinyal latar belakang yang lebih rendah disebabkan
tingginya potensial ionisasi pelarut standar seperti metanol dan air (masing-masing,
IP 10.85 dan 12.62 eV) yang tidak terionisasi oleh lampu kripton.
Gambar 5 Fotoionisasi tekanan
atmosfer (APCI) spektrometer massa
Kelemahan dari ESI dan APCI yaitu dapat menghasilkan ion latar belakang dari pelarut. Selain itu, ESI sangat rentan terhadap efek supresi ion, dan APCI membutuhkan suhu penguapan berkisar 350-500 °C, yang dapat menyebabkan degradasi termal.
Ionisasi
induksi APPI melalui dua mekanisme yang berbeda. Yang pertama adalah fotoeksitasi langsung, memungkinkan untuk ejeksi elektron dan ion kation radikal positif (M+). Sumber APPI menggunakan energi cahaya yang lebih tinggi dari potensi ionisasi (IP) dari sebagian besar molekul target, tetapi lebih rendah dari sebagian besar IP udara dan molekul pelarut, sehingga menghilangkan pengganggu. Selain itu, karena sedikit kelebihan energi disimpan dalam molekul
sehingga terjadi fragmentasi minimal. Mekanisme kedua yaitu fotoinduksi ionisasi
kimia tekanan atmosfer yang mirip dengan APCI melibatkan transfer muatan untuk menghasilkan protonasi (MH+) atau kehilangan proton ([M-H]-) untuk menghasilkan ion negatif.
Untuk memulai ionisasi kimia, pereaksi fotoionisasi
(dopan) ditambahkan ke eluan. Setelah fotoionisasi dari dopan, transfer muatan terjadi pada analit. Dopan untuk muatan positif meliputi aseton dan toluena,
tetapi aseton juga dapat
berfungsi
sebagai dopan untuk
muatan negatif. Mekanisme ionisasi (M+ vs [M+H]+) molekul tergantung pada afinitas proton dari analit, pelarut, dan jenis dopan
yang digunakan.
·
Matrik
dibantu laser desorpsi/ionisasi (MALDI)
Matrix dibantu laser desorpsi/ionisasi spektrometer massa (MALDI-MS) merupakan
alat analisis untuk peptida, protein, dan sebagian besar biomolekul lainnya (oligonukleotida, karbohidrat, produk alami, dan lipid). Transfer energi yang efisien dan diarahkan selama desorpsi matrik
dibantu induksi laser memberikan hasil ion yang
tinggi
untuk analit utuh dan memungkinkan untuk pengukuran senyawa dengan sensitifitas
sampai sub
pikomol, dapat
juga untuk
analisis sampel heterogen biologis kompleks seperti mencerna proteolitik.
Dalam analisis MALDI, matriks memainkan peran kunci dalam teknik ini. Matriks MALDI berupa bahan padat nonvolatil yang
memfasilitasi
proses desorpsi dan ionisasi dengan menyerap radiasi laser,
sehingga matriks dan sampel tertanam dalam matriks menguap. Matriks juga berfungsi untuk meminimalkan kerusakan sampel dari radiasi laser dengan menyerap sebagian besar energi biasa..
Gambar 6 Transfer energi pada MALDI
Mekanisme desorpsi/ionisasi yang tepat untuk MALDI belum diketahui, tetapi
dipercaya bahwa MALDI menyebabkan ionisasi dan transfer sampel dari fase terkondensasi ke fase gas melalui eksitasi laser sampel matriks (Gambar 6). Analit pertama terkristalisasi dari
kelebihan molar senyawa matriks
yang biasanya
berupa asam organik lemah
yang menyerap UV. Molekul-molekul sampel terkristalisasi juga menguap, tetapi tidak langsung menyerap energi dari laser.
Setelah dalam fase gas, molekul bermuatan yang terdesorbsi kemudian diarahkan elektrostatis dari sumber ionisasi MALDI ke analisis massa. Time-of-flight (TOF) analisis massa sering digunakan untuk memisahkan ion yang
sesuai berdasarkan
massa- rasio
muatan (m/z) masing-masing.
Gambar
7 Matriks MALDI
Tabel 2 Keuntungan dan
kerugian MALDI
Keuntungan
|
Kerugian
|
·
Rentang massa hingga
300.000 Da.
|
· Tidak
dapat digunakan pada senyawa dengan rentang massa di bawah 700 Da
(tergantung bahan matrik).
|
·
Sensitifitas khas pada femtomol rendah untuk picomol rendah. Juga memungkinkan untuk sensitifitas attomol
|
·
Kemungkinan foto-degradasi
oleh desorpsi/ionisasi laser
|
·
Ionisasi lembut
dengan sedikit atau tidak ada fragmentasi
|
·
Matriks asam yang digunakan dalam MALDI dapat menyebabkan degradasi pada beberapa senyawa.
|
·
Toleransi garam dalam konsentrasi milimolar
|
|
· Cocok untuk analisis senyawa kompleks
|
Pemanfaatan MALDI dalam analisis
biomolekul terletak pada kemampuannya untuk memberikan informasi mengenai
berat molekul pada molekul utuh. Kemampuan untuk menghasilkan informasi yang akurat sangat berguna untuk identifikasi dan karakterisasi
protein.
·
Desorpsi/ionisasi
pada silikon (DIOS)
DIOS adalah metode matriks bebas yang menggunakan getaran
laser
desorpsi/ionisasi pada silikon (Gambar 8). Permukaan silikon berupa silikon berpori atau kawat nano silikon semikonduktor yang menyerap UV dengan area permukaan besar (ratusan m2/cm3). Untuk aplikasi laser desorpsi/ionisasi spektrometer massa, struktur silikon terstruktur menggunakan perancah untuk mempertahankan molekul pelarut dan analit, dan absorptifitas UV memberi mekanisme untuk transfer energi laser untuk analit. Kombinasi ini memungkinkan
karakteristik DIOS digunakan untuk berbagai macam
analisis biomolekul termasuk peptida, karbohidrat, dan senyawa organik kecil dari berbagai jenis.
Gambar 8 DIOS menggunakan getaran laser UV dari permukaan silikon terstruktur untuk menghasilkan ion fase gas utuh
DIOS memiliki banyak kesamaan dengan MALDI. Instrumentasi
dan akuisisi dengan menggunakan DIOS-MS hanya membutuhkan sedikit penyesuaian
dengan pengaturan MALDI, chip hanya
ditempelkan pada piring
mesin
MALDI dan dimasukkan ke dalam spektrometer. Panjang gelombang
sinar laser yang sama (337 nm)
yang
digunakan dalam MALDI efektif
juga
untuk DIOS. Dalam hal sensitifitas DIOS sebanding dengan
MALDI yaitu memiliki beberapa
keuntungan : latar belakang rendah dalam kisaran massa rendah, deposisi sampel
air seragam dan penanganan sampel disederhanakan. Selain itu, format berbasis
chip dapat disesuaikan dengan penanganan sampel otomatis, dimana laser dapat memindai dari bagian ke bagian
lain dalam DIOS sehingga bisa mempercepat dan mempermudah analisis senyawa dengan
berat molekul rendah.
·
Atom
cepat/ion pemboman (FAB)
Pemboman ion atom cepat (atau FAB), merupakan sumber ionisasi
yang mirip dengan MALDI karena menggunakan matriks dan sinar yang sangat aktif
dari partikel untuk desorpsi
ion dari permukaan. Perbedaan antara MALDI dan FAB
yaitu pada MALDI, sinar yang
digunakan berupa getaran sinar laser, sedangkan FAB menggunakan sinar ion kontinyu. Matriks MALDI biasanya berupa
kristal padat, sedangkan FAB biasanya memiliki matriks cair. FAB 1000 kali lebih sensitif dibandingkan MALDI.
Gambar 9 FAB
spektometri massa
Pemboman atom cepat
(FAB) adalah sumber ionisasi lunak yang memerlukan penggunaan probe penyisipan langsung untuk pengenalan sampel dan atom
netral Xe atau ion Cs+ untuk menempelkan sampel dan matriks dari probe penyisipan permukaan langsung,
hal
ini untuk mendeteksi ion matriks dalam spektrum FAB serta ion molekul terprotonasi atau kationik (yaitu M + Na+)
dari analit.
Matriks
FAB memfasilitasi proses desorpsi dan ionisasi, matriks FAB adalah bahan cair mudah menguap yang berfungsi untuk terus-menerus mengisi permukaan dengan sampel baru seperti dibombardir oleh sinar ion. Dengan menyerap sebagian besar energi, matriks juga meminimalkan degradasi sampel dari sinar partikel energi tinggi.
Dua matriks yang paling umum digunakan dalam FAB adalah gliserol
dan m-nitrobenzil alkohol. Atom-atom cepat atau bertabrakan dengan matriks akan
menyebabkan matriks dan analit akan teradsorpsi ke fase gas. Setelah dalam fase gas, molekul bermuatan dapat mendorong elektrostatis ke analisis massa.
·
Ionisasi
elektron (EI)
Elektron ionisasi adalah salah satu sumber ionisasi yang paling penting untuk analisis rutin kecil, hidrofobik, molekul termal stabil dan masih banyak lagi,
karena EI biasanya menghasilkan banyak ion fragmen.
Gambar 11 Ionisasi
elektron
Sampel dikirimkan sebagai gas dari probe melalui desorpsi termal, atau melalui kapiler. Setelah dalam fase gas senyawa masuk ke dalam sumber ionisasi elektron, dimana elektron merangsang molekul, sehingga menyebabkan ejeksi ionisasi
elektron dan fragmentasi.
Kegunaan ionisasi elektron berkurang secara signifikan untuk senyawa dengan berat molekul diatas
400 Da karena desorpsi termal yang diperlukan sampel sering menyebabkan dekomposisi termal sebelum penguapan dapat terjadi. Masalah utama yang terkait dengan desorpsi termal dalam ionisasi elektron yaitu ketidakstabilan molekul besar, dekomposisi termal dan fragmentasi yang berlebihan.
Metode atau mekanisme ejeksi
elektron untuk hasil pembentukan ion positif sebagai berikut:
·
Sampel termal menguap.
·
Elektron dikeluarkan dari filamen, dipanaskan dan
dipercepat melalui medan listrik pada 70 V untuk membentuk berkas elektron terus menerus.
·
Sampel molekul melewati berkas elektron.
·
Elektron, yang
berisi 70 V dari energi kinetik (70 elektron volt atau 70 eV), mentransfer sebagian energi kinetiknya untuk molekul. Hasil transfer dalam ionisasi (ejeksi elektron) dengan ion internal biasanya memiliki kelebihan
energi yang
tidak lebih dari 6 eV.
M + e- (70 eV) → M+ (~5 eV) + 2e- (~65 eV)
·
Kelebihan energi
(6 eV) dalam molekul menyebabkan perubahan fragmentasi
beberapa drajat.
M+ → ion molekul
+ ion fragmen + fragmen netral
·
Ionisasi
kimia (CI)
Ionisasi
kimia (CI)
diterapkan pada sampel yang sama dengan yang dianalisis oleh EI dan digunakan
untuk meningkatkan kelimpahan ion molekuler. Ionisasi kimia menggunakan fase
gas reaksi ion-molekul dalam vakum dari spektrometer massa untuk menghasilkan
ion dari molekul sampel. Proses ionisasi kimia dimulai dengan pereaksi
gas
seperti metana, isobutana atau amonia, yang terionisasi oleh dampak elektron .
Tekanan gas tinggi pada sumber ionisasi adalah
hasil dari reaksi ion-molekul antara pereaksi
gas ion dan pereaksi
gas netral. Beberapa produk
dari reaksi ion-molekul dapat bereaksi dengan molekul analit untuk menghasilkan
ion .
Mekanisme yang mungkin
untuk ionisasi CI yaitu :
Reagen (R) + e-
→ R+ + 2 e–
R+ + RH → RH+ + R
RH+ + analit (A) → AH+ + R
Berbeda dengan EI, analit lebih mungkin untuk memberikan
ion molekul dengan mengurangi fragmentasi menggunakan CI. Namun, sampel harus
termal stabil karena penguapan dalam sumber CI terjadi melalui pemanasan.
3.
Analisis Massa
Ada empat jenis umum dari analisis massa yang
dapat digunakan untuk
pemisahan ion dalam spektrometri massa
(Chemwiki 2014).
·
Quadrupole Analisis
Massa
Quadrupole adalah analisis massa yang menggunakan medan listrik
untuk memisahkan ion. Quadrupole terdiri atas 4 batang/tiang
yang paralel, di mana batang yang
berdekatan memiliki polaritas tegangan
yang berlawanan. Tegangan yang diterapkan pada
setiap batang adalah penjumlahan
dari tegangan konstan
DC (U) dan frekuensi radio yang
bervariasi (Vrfcos (wt)), dimana w adalah
frekuensi sudut dari bidang
frekuensi radio. Gaya
listrik pada ion menyebabkan
ion berosilasi/orbit di daerah antara 4
batang, di mana jari-jari
orbit tetap konstan.
Gambar
12 Quadrupole Analisis
Massa
Pergerakan ion dalam gerakan yang sangat kompleks berbanding lurus dengan massa
ion, tegangan pada quadrupole, dan frekuensi radio. Ion-ion akan
tetap mengorbit di daerah antara
kutub tanpa terjemahan
sepanjang kutub kecuali
ion memiliki kecepatan
konstan yang dibuat sebagai
ion yang memasuki quadrupole tersebut. Sebelum memasuki analisis, ion melewati potensi tegangan tertentu (biasanya dibuat oleh elektroda
cincin) untuk memberikan ion kecepatan konstan sehingga
dapat melintang di sepanjang
pusat quadrupole tersebut.
Sementara di quadrupole, lintasan ion berubah sedikit berdasarkan
massanya. Ion massa
tertentu memiliki frekuensi tertentu dimana semakin besar massa, semakin
besar frekuensinya.
·
TOF (Time of Flight) Analisis Massa
Prinsip-prinsip dasar analisis massal
menggunakan TOF analisis massa relatif mudah
jika dibandingkan
dengan banyak perangkat analisis massa
lainnya
dimana ion diambil (atau
diproduksi) dalam ledakan singkat
atau paket dalam sumber ion dan dikenakan tegangan
percepatan. Ion kemudian
melayang atau terbang dimana
kecepatan ion tergantung pada massa
(m) dan muatan (z). Analisis massa ini berguna karena semua
ion yang dideteksi
(hampir) bersamaan
dapat memindai rentang massa semua ion
dengan sangat cepat,
menyebabkan sensitifitas pada instrumen juga meningkat.
·
Quadrupole Ion Perangkap Analisis Massa
Analisis ini menggunakan prinsip yang sama seperti analisis quadrupole dengan menggunakan medan listrik untuk pemisahan
ion. Spektrometer massa perangkap ion bekerja
berdasarkan kekuatan ion dalam perangkap, dan memanipulasi ion dengan menggunakan tegangan
konstan dan
bidang retensi. Amplitudo tegangan
yang
diterapkan memungkinkan analisis
massa perangkap
ion membuat ion terperangkap
pada perangkat analisis, dimana ion yang
tidak terseleksi diberikan lintasan
oleh medan elektrostatik yang menyebabkan mereka untuk keluar dari
perangkap dengan mengisi perangkap dengan fragmentasi
gas inert dari ion
yang dipilih
sehingga ini berguna ketika informasi struktural diperlukan.
Sistem memiliki kemampuan yang unik
yaitu memindai beberapa produk ion yang sensitif dengan sangat baik. Spektrum yang diperoleh dengan
analisis massa perangkap ion mungkin berbeda secara
signifikan karena diperoleh dari sistem quadrupole
tiga dimana terjadi tabrakan energi
atau gas dalam sistem.
·
Ion
Cyclotron Resonance (ICR)
ICR
adalah perangkap ion yang menggunakan medan magnet untuk menangkap
ion ke dalam orbit di dalamnya.
Dalam analisis ini
tidak ada pemisahan yang terjadi karena tidak semua ion dapat terjebak di dalam sehingga medan listrik eksternal diterapkan untuk
membantu menghasilkan sinyal .
Frekuensi
orbit tergantung pada muatan dan massa ion, bukan dari kecepatan. Jika medan magnet tetap konstan, muatan untuk rasio massa dari masing-masing ion dapat
ditentukan dengan mengukur kecepatan sudut. Muatan dari ion-ion yang berlawanan memiliki kecepatan sudut yang sama, yang
membedakan hanyalah mengorbit dalam
arah yang berlawanan.
Dalam orbit energi tinggi, seperti
ion yang berosilasi antara dua piring, elektron
menumpuk di salah satu piring atas yang lain dan mendorong arus untuk
berosilasi, berbanding lurus dengan jumlah ion dalam sel pada frekuensi tertentu.
Fourier Transform ICR
(FT-ICR), digunakan
untuk diferensial sinyal yang
dijumlahkan untuk menghasilkan hasil yang diinginkan.
4.
Detektor
Setelah ion keluar dari analisis massa, ion tersebut harus dideteksi dan diubah menjadi sinyal yang dapat digunakan. Detektor merupakan elemen penting dari spektrometer massa yang menghasilkan sinyal dari ion dengan menghasilkan elektron sekunder, yang selanjutnya diperkuat dengan menginduksi arus (dihasilkan dengan
memindahkan beban).
Sistem detektor ion terbagi
dalam dua kelas utama
:
1. Detektor titik: ion
tidak spasial diselesaikan dan berurutan menimpa
detektor yang terletak pada satu titik dalam
geometri spektrometer.
Gambar
13 Detektor titik
2. Detektor array: ion
secara spasial diselesaikan dan semua ion tiba
secara bersamaan (simultan atau dekat) dan dicatat
di sepanjang pesawat menggunakan bank detektor.
Gambar 14 Detektor array
B.
Cara
Kerja LC-MS
Cara kerja kromatografi
cair adalah sama dengan HPLC atau kromatografi cair lainnya. Sedangkan cara
kerja spektrometer massa menggunakan metode ESI
(Wibowo 2011) adalah sebagai berikut :
Gambar 15 Proses pemisahan analit
pada kromatografi cair sampai dengan penyemprotan (penyemprotan oleh spray needle tip)
1.
Analit bersama dengan eluen dari syringe
pump atau LC masuk ke dalam kapilari.
Di dalam kapilari terdapat anoda (kutup negatif) pada Taylor cone dan katoda (kutup negatif)
didekat masukkan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi agar muatan yang
berkumpul pada Taylor cone adalah
muatan positif sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk
droplet (tetes–tetes) tidak bergabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.
2.
Analit dan solven (eluen) disemprotkan (spray) melalui Taylor cone.
Akan terbentuk droplet–droplet yang akan mengalami tahap
evaporasi solven untuk mengurangi solven yang menempel di analit.
3. Droplet yang mengalami ledakan kolom tersebut
akan masuk ke dalam cone dimana di
sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N2). Gas ini berfungsi agar
analit yang terjadi stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh
gas oksigen. Droplet tersebut ditransfer melalui lubang kapiler untuk
dianalisis menggunakan spectrometer massa.
Gambar 16 Proses setelah analit dipisahkan oleh Liquid Chromatography
Analit yang terikut dalam eluen masuk ke dalam jarum
penyemprot/kapiler, kemudian eluen bersama analit disemprotkan menjadi bentuk
tetes-tetes (droplet). Tetes-tetes tersebut masuk ke dalam counterelectrode
(biru). Tetesan masuk melalui kapiler transfer kemudian menuju spektrometer
massa.
Pada jarum kapiler terdapat Taylor cone dimana daerah tersebut bermuatan negatif sehingga
analit dalam solven yang memiliki muatan positif akan berkumpul di daerah Taylor cone, pada saat terjadi
penyemprotan, tetesan-tetesan (droplet) permukaannya memiliki muatan positif.
Droplet mengalami evaporasi solven, akibatnya droplet
menyusut sampai titik dimana tegangan permukaan pada droplet tidak dapat
menopang muatan dipermukaannya sehingga terjadi perpecahan dalam droplet
tersebut yang disebut “coulombic” ledakan menjadi bagian-bagian, dimana
bagian-bagian tersebut antara lain :
a.
Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit
ion)
b.
Satu analit bersama solven yang diliputi oleh muatan
positif
c. Beberapa
analit bersama beberapa molekul solven dan diliputi oleh beberapa muatan
positif.
Gambar 17 Proses droplet berubah menjadi analit
Muatan positif pada solven biasanya ditambahkan dari ion-ion
Na+, Li+, K+, NH4+ dan
kationik lainnya. Akibatnya pada spektra sering terjadi penambahan berat
molekul ion-ion tersebut disamping penambahan berat molekul solven. Ion harus
dibuat bermuatan positif agar masing-masing tetesan (droplet) tidak saling
menempel lagi (membentuk tetesan yang lebih besar). Tetesan (droplet) dapat
bermuatan positif atau negatif tergantung dari daya yang ditempelkan pada kapilari.
Untuk ion negatif digunakan Cl-.
C.
Aplikasi LC-MS
a. Bidang
farmasi
·
Identifikasi benzodiazepin
·
Identifikasi
metabolisme asam empedu
b. Bidang
biokimia
·
Identifikasi protein
c.
Bidang klinik
·
Deteksi sensitifitas trimipramin dan
thioridazine dalam sampel urin
d. Bidang
makanan
·
Identifikasi aflatoksin dalam makanan
·
Determinasi vitamin D3 dalam suplemen pakan ternak
e.
Bidang
lingkungan
·
Deteksi herbisida fenil urea
·
Deteksi rendahnya
tingkat karbaril dalam makanan
III. Kesimpulan
Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS) merupakan
teknik analisis yang menggabungkan kemampuan
pemisahan fisik dari kromatografi cair dengan spesifisitas deteksi spektrometri massa.
LC-MS dapat digunakan untuk memberikan informasi tentang berat molekul, struktur, identitas dan kuantitas komponen sampel tertentu.
LC-MS yaitu dapat menganalisis lebih luas berbagai komponen, seperti senyawa termal labil, polaritas tinggi atau bermassa molekul tinggi, bahkan juga protein. Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi relatif
dengan lapisan kimia partikel-partikel (fase diam) dan elusi pelarut melalui kolom (fase gerak). Komponen elusi dari kolom kromatografi kemudian diteruskan ke spektrometer massa melalui antarmuka khusus
untuk
kemudian diidentifikasi oleh spektrometer massa.
Daftar
Pustaka
Agilent. 1998. Basic of LC/MS. www.chem.agilent.comlibrary...a05296.pdf diakses pada tanggal 01 Maret 2014.
Agilent. 2001. Basic of LC/MS. http://www.chem.pitt.eduwipfAgilent%20LC-MS%20primer.pdf.
diakses pada tanggal 01 Maret 2014.
Chemwiki. 2014. Mass Analyzer (Mass Spectrometry). http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Instrumental_Analysis/Mass_Spectrometry/Mass_Spectrometers_%28Instrumentation%29/Mass_Analyzers_%28Mass_Spectrometry%29
diakses pada tanggal 10 Maret 2014
Gates P.. 2005. High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry (HPLC/MS).
http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html
diakses pada tanggal 01 Maret 2014
Himawan R. F.. 2010. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
http://rafaeljosephhimawan.blogspot.com/2010/04/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt.html
diakses pada tanggal 03 Maret 2014.
Isnawati R.. 2013. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2013/02/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc.html
diakses pada tanggal 03 Maret 2013.
Lee M. S., Kerns E. H.. 1999. LC/MS applications in
drugs development. Mass Spectrometry
Reviews 18 (3-4): 187-279.
Linscheid M. & Westmoreland D. G.. 1994.
Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Pure & Appl. Chem. Vol 66 No. 9 pp. 1913-1930.
Scrip. 2014. Mass Spectrometry. http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php
diakses pada tanggal 03 Maret 2014
Sumbono A.. 2010. Kromatografi Cair Spektrometri Massa. http://ecimansorong.blogspot.com/2010/05/normal-0-false-false-false-en-us-x-none.html,
diakses pada tanggal 01 Maret 2014
Wibowo A.E.. 2011. LC-MS (Liquid Chromatograpy-Mass
Spectroscopy). http://ithengcemani.blog.ugm.ac.id/2010/12/04/liquid-cromathograpy-mass-spectroscopy-with-electrospray-ionization-methode-lc-ms-esi-2/
diakses pada tanggal 08 Maret 2014
Tidak ada komentar:
Posting Komentar